Phương pháp được chia làm 4 phản ứng thực hiện riêng rẽ có DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP (deoxynucleotide), enzyme Taq polymerase, dung dịch đệm và các điều kiện phản ứng thích hợp đồng thời có bổ sung thêm khoảng 1% một loại ddNTP (dideoxynucleotide) cho mỗi phản ứng khác nhau. Các dideoxynucleotide bị mất 2 nguyên tử oxy ở carbon thứ 3 và carbon thứ 4. Do đó khi mạch DNA đang tổng hợp bị gắn 1 ddNTP thì không có nhóm 3'-OH ở nucleotide cuối cùng nên mạch đang tổng hợp không được kéo dài tiếp tục phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại.

Chính do lượng ddNTP được đưa vào với một lượng nhỏ so với lượng dNTP nên thỉnh thoảng mới có một ddNTP được sử dụng ngẫu nhiên làm phản ứng tổng hợp DNA dừng lại. Kết quả sẽ tổng hợp được các đoạn nucleotide có kích thước dài ngắn khác nhau.Để xác định trình tự, người ta điện di kết quả thu được trên gel polyacrylamid. Các đoạn oligonucleotide có kích thước khác nhau sẽ di chuyển với tốc độ khác nhau trên bản gel. Lúc này thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát được các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel. Tổng hợp kết quả sẽ thu được trình tự sắp xếp các nucleotide của đoạn gen.